母乳是婴儿成长过程中重要的食品，国内外的孕婴保健机构都建议初生婴儿采用母乳喂养。母乳中含有的营养成分，如蛋白质、脂肪、维生素、矿物质等，易于婴儿吸收。另外其所含有的抗感染因子，如IgA、乳铁蛋白、溶菌酶及各种细胞成分，可增强婴儿的免疫能力。因此，母乳中营养成分研究也成为营养学的一大领域。目前，已有对母乳中的维生素进行研究并加以报道，但少有氨基酸的研究报道。本研究采用酸性条件下水解母乳中蛋白质，柱前在线衍生与液相色谱紫外联用分析母乳中氨基酸。

 

样品前处理

 

17种氨基酸混标溶液（除胱氨酸浓度为1.25μmol/ml，其它氨基酸浓度为2.5μmol/ml）

 

7M盐酸：量取558ml盐酸，用水稀释至1000ml量瓶中，摇匀。

 

样品由第三方医疗机构收集不同哺乳期妇女的乳液样品。样品呈乳白色悬浊液（含有少量黄色液体油脂。低温保存时，样品取出后放置在40°C水浴中使固体油脂融化）。

 

水解：吸取1ml脱脂后的母乳样品转移至真空水解管中，加入0.6ml水解催化剂，在0.05MPa压力下充氮保护3分钟，再减压脱气3分钟，密塞水解管并置于沸水浴上恒温加热8小时，冷却至室温，用40%氢氧化钠溶液调节pH值2-3范围内，用0.1N盐酸溶液稀释并定容至10ml，摇匀并用微孔（0.22μm）滤膜过滤用于液相分析。

 

 

衍生程序

采用邻苯二甲醛和氯甲酸芴甲酯在碱性条件下分别与一级氨基酸和二级氨基酸发生反应，生成具有强烈紫外吸收的化合物。衍生过程在自动进样器中进行。

 

衍生试剂：

硼酸缓冲液： 200mM 四硼酸钠溶液（pH=10.2）

邻苯二甲醛溶液（OPA）：50mg/ml(甲醇)

OPA/MPA溶液：0.8ml 硼酸缓冲液-0.2ml OPA溶液-20μl 3-巯基丙酸

氯甲酸芴甲酯（FMOC）溶液：2.5mg/ml（乙腈）

稀释液：流动相A

 

衍生过程：200mM 硼酸缓冲液（5μL）+样品（1μL）+OPA/MPA溶液（1μL）+FMOC溶液（1μL）+稀释液（8μL）

 

仪器型号：

UltiMate3000:

LPG-3400，SN:8014896

WPS-3000TSL, SN:8014671

TCC-3000, SN:801179

DAD， SN:8037084

变色龙®色谱管理软件（Chromeloeon®6.8 SR11）

 

 

色谱条件：

色谱柱 ： Hypersil GOLD C18色谱柱, 4.6×250mm, 5μm, PN:25005-254630

 

流动相 ：A: 20mM 乙酸钠（加0.018%三乙胺，调节pH值至7.2，再加入0.3%四氢呋喃），B：100mM乙酸钠（pH=7.2）-乙腈-甲醇（20:40:40）

 

梯度洗脱程序

 

进样量： 1μL

检测器：检测波长：380nm, 262nm, 3D扫描：190-400nm，采集频率：5Hz

流速： 1000μL/min

柱温：  35°C

 

实验数据

 

01

水解条件优化

在水解过程中，加热温度、水解持续时间和催化剂用量对水解有着重大影响。结合实际情况采用沸水浴加热进行水解，因此利用响应面法对水解时间和催化剂用量的影响进行了研究，结果见表1和图1。

 

 

表1 水解研究方案

 

图1 氨基酸水解优化结果

从图1中可以看出，水解时间延长对氨基酸增加效果不明显，水解催化剂用量对水解效率有显著影响，随着用量增大，氨基酸含量明显增加，且达到大值，再增加用量时，氨基酸含量开始降低，可能原因是水解后的氨基酸在强酸性环境与高温加热条件下中发生降解从而引起含量降低。综合实际操作考虑，故用0.6ml水解催化剂在沸水浴中水解8小时可获得佳水解氨基酸含量。

 

02

 方法专属性

取0.1N盐酸做为空白试剂考察方法专属性，结果见图2和3。

 

 

03

线性范围

取氨基酸混标溶液用1%盐酸（约0.1N）稀释成浓度为0.025、0.05、0.125、0.25、0.50μmol/ml的溶液，按照前述条件测定其响应值，并与浓度做线性回归，结果见表4。

 

04

方法精密度

取对照品溶液，连续进样5针，结果见图4。

 

05

方法度

按前述方法平行测定母乳样品与加标样品，计算其含量与加标回收率。结果见图5与表5。

 

表5加标回收率（样品编号：12-8，n=2）

 

结论

 

通过上述方法学考察结果分析，本方法具有线性范围宽、专属性强、结果准确，可用于母乳中测定氨基酸含量。