我们在实验过程中经常遇到这样的问题：

 

实验室新买了UHPLC,想要将原来的HPLC方法转移到新的机器上,却不知道该怎么着手？

 

在文献中查找到一个UHPLC建立的快速分析方法，如何将这个方法转移到仅有HPLC的实验室呢？

 

今天来为大家讲一讲，HPLC和UHPLC之间的方法转换时应该注意哪些问题？怎样来选择合适的色谱柱？

 

主要内容

1. 方法转换中的不可变条件

2. 方法转换中的变化条件 

3. 方法转换中的基本调整规则

 

1. 方法转换中的不可变条件

 

在方法转换的时候，为了达到良好的分离情况，我们应该尽可能保持与HPLC分析方法中的主要分离条件一致。

 

(1) 在色谱柱中使用填料的性质和选择性应当相同。

(2) 使用的流动相组成（强洗脱有机溶剂、缓冲物组成、pH等）应该相同。

(3) 检测器的工作条件（检测波长）应该相同。

(4) 柱温应当相同。

 

2. 方法转换中的变化条件

 

方法转换的过程中，通常是通过更换与UHPLC系统相匹配的，具有相同分离性能的色谱柱规格，调整流速来提高分离效率。

 

以下几点是我们需要特别注意的地方。

 

(1) 填料的粒径由大变小。

(2) 色谱柱的内径由宽变窄。

(3) 色谱柱的长度由长变短。

(4) 色谱柱的压力降由低变高。

(5) 色谱仪系统的死体积和梯度滞留体积由大变小。

(6) 流动相的流速由大变小。

(7) 洗脱时间由长变短。

 

3. 方法转换中的基本调整规则

 

现在，大家已经了解 HPLC→UHPLC 方法转换时应该注意的可变条件和不可变条件了，那么具体怎么操作呢？

 

下面让我们通过一个例子来掌握这项实用的工作技能吧。

 

例如，一个HPLC分析方法，使用色谱柱的规格是 4.6mm×250mm×5um；流速为1mL/min,柱压为10Mpa,进样体积为10uL.

 

那么，如果换成粒径为2um的UHPLC柱，柱长、流速、压力、进样量该如何来选择呢？

 

我们可以按照下面的步骤逐步来计算：

调整步骤

柱长、粒径的选择

流速的调整

色谱柱的压力

进样量的调整

（1）色谱柱规格的调整

首先引入一个分离效能的概念：

 

Se=L/dp

式中，L为色谱柱的柱长,mm;dp为色谱柱粒径,um。

 

对于不同的色谱柱，只要能保持柱长和粒径的比值相同，那么分离效果就是差不多的。

 

柱长的计算：

L2=L1×(dp2/dp1)

 

L2=250×(2/5)mm=100mm

 

根据以上计算结果，我们就可以选择规格为2.1mm×100mm×2um的CAPCELL PAK IF2 色谱柱了。

 

（2）流速的调整

 

我们还是利用上面这个例子，现在规格选好了，那么流速设置多少更合适呢？

 

流速的计算：

式中，F为流速，dc为色谱柱内径，dp为填料的粒径。

 

F2=1×(2.1/4.6)×(2.1/4.6)×(5/2)mL/min=0.52mL/min

 

根据以上计算结果，我们可以将流速设置为0.52mL/min.

 

 

（3）色谱柱的压力

 

柱压的计算一般使用下面的公式：

 

 

按上述计算方法，确定色谱柱规格和流速以后，在估算色谱柱的压力时，可以仅考虑填料粒径的影响，近似式为

式中，p为柱压。

 

p2=10×(5/2)×(5/2)Mpa=62.5Mpa

 

CAPCELL PAK  IF2 具有超高的耐压性能，耐压可达100Mpa，*符合替换要求。

 

 

（4）进样量的调整

 

对进样量的计算：

式中：Vinj 为进样量。

 

V2=10×(2.1/4.6)×(2.1/4.6)×(100/250)=0.83uL

 

在这里留个思考题：

 

色谱柱规格变化之后，为什么要调整进样量呢？

 

您可以根据自己试验的实际情况或检测限的要求来调整进样量。

 

 

这个开始看似很复杂的方法转换问题，经过我们一步一步地计算，是不是变得很简单了呢？

 

HPLC→UHPLC的转换结果

 

如果您现在正好有HPLC的项目，可以自己尝试转化成UHPLC方法，不仅可以提高分离效率，还能省下不少试剂呢！